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SDS-PAGE胶染色

发布者:米乐app下载(中国)官网 科技    发布时间:2021-05-21     
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一、各种蛋白染色方法的灵敏度比较


silver1.png


二、考马斯亮蓝染色


CBB 染色液


0.5%考马斯亮蓝 G250 或 R250


40%甲醇


10%乙酸


将 CBB 溶于甲醇中并不停的搅拌 15min。加入乙酸与 ddH2O


脱色液:30%甲醇


10%乙酸


染色方法:1.在摇床上染色 30min.


2.脱色至蛋白点或条带清晰可见


3. ddH2O 洗 3-5 次


三、胶体考马氏亮蓝染色Colloidal Coomassie Staining(Cambridg ecentre for porteomics)


sensitivity = ~100ng


1.固定:甲醇/醋酸/H2O(45:1:54)至少 20min.


2. 染色 12-18hr。


染色液:


17% (w/v) 硫酸铵


34%甲醇


0.5%醋酸


0.1% (w/v) Coomassie G250


3. 脱色:用 H2O 脱色至蛋白点和背景清晰.


双向电泳蛋白点的切取和保存


1.用 PDQuest 软件或肉眼比对,找出感兴趣的蛋白点,并做好标记和记录。


2. 用 MilliQ 水冲洗胶 2 次。


3. 用色谱纯甲醇和 MilliQ 水冲洗 Ep 管


4. 将枪头(200ul)下端剪去,使其内径略小于蛋白斑点的直径,用色谱纯甲醇和MilliQ 水冲洗枪头。


5. 对准斑点中央小心将蛋白切割下来,放入 Ep 管,MilliQ 水漂洗 2 次,如胶块太大,将其切成 1 x 1 mm 的胶片。


6.将切好的点做好标记和记录,置-80oC 保存或冻干后-20oC 存放。


注意事项:


1.尽量避免皮肤和头发的角蛋白的污染,在操作过程中应戴一次性的 PE 手套(不用乳胶手套)和帽子。


2. 不要将胶长期存放于乙酸溶液中。


3. Ep 管及染胶的容器必须用甲醇和水充分清洗,尤其应与进行 Western blotting的容器分开,以避免 casein 或 BSA 的污染。


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