一、鼠对鼠染色注意事项

用鼠抗体对鼠组织染色是个复杂的过程，因为容易导致背景染色高，而且很难消除。 形成这种背景主要是由于组织染色时二抗与内源性的鼠 IgG，或 B 细胞、浆细胞及巨噬细胞上的 Fc 受体结合造成的。

不能保证鼠单克隆抗体与鼠组织（除非说明书有显示）。然而，必需鼠对鼠染色时，应用一些窍门可能会有助于减少这些背景染色。

封闭内源性 IgG

1.按常规制备组织切片。

2.在封闭步骤，用血清（与二抗同种动物来源）室温封闭 30 分钟。

3.PBS-吐温-20 冲洗 3 X 2 分钟。

4.组织切片与未结合的抗鼠 IgG 的 AffiniPure Fab 片段（H+L）室温孵育 1 小时或 4°C 过夜。建议封闭抗体浓度用 0.1 mg/ml，但是否是最佳浓度仍需终端用户来评估。

5.抗体染色。

封闭内源性Fc受体

以单克隆二抗F（ab）段封闭内源性 Fc 受体，有市售试剂盒。

有助于降低背景染色的其它窍门

1.切片在含 1% Triton 的 PBS 中室温孵育 30 分钟，“清净”组织。

2.TBS–吐温-20 作为冲洗缓冲液比 PBS-吐温-20 更能减少背景染色。

二、疑难解答提示

无染色

一抗和二抗不匹配

使用针对一抗的二抗（如一抗来自兔，二抗为抗兔抗体）

没有足够的一抗与目标蛋白结合

使用低稀释度抗体。延长 4℃ 孵育时间（如过夜）。

抗体的天然结构（3D 形态）受损不适用于 IHC

用天然（非变性的）WB法检测抗体，确保抗体没被损坏。

由于不当储存、稀释或反复冻融造成一抗/二抗试剂盒失效

做阳性对照确认一抗/二抗试剂盒的有效性。

靶组织中没有目标蛋白

参照抗体供应商的建议做阳性对照。

组织中没有足够的目标蛋白

应用信号放大操作。

没有避光保存二抗

避免将二抗处于光照下。

脱蜡不彻底

延长脱蜡时间，更换二甲苯。

固定步骤（使用福尔马林和多聚甲醛固定剂）修饰了抗体识别表位

抗原修复法暴露出抗原表位，缩短固定时间。

蛋白位于细胞核内（核蛋白），抗体不能穿透核膜

在封闭液和抗体稀释液中加入通透剂。

PBS 缓冲液被细菌污染后破坏了靶蛋白的磷酸根

在抗体 PBS 储存液中加入 0.01% 叠氮化合物，或使用新鲜无菌的 PBS。

高背景

没有封闭非特异性结合或封闭不充分

延长封闭时间，并考虑改换封闭剂。Abcam 建议用 10% 正常血清封闭切片 1 小时或 1-5% BSA 封闭培养细胞 30 分钟。

一抗浓度过高

滴定法寻找到最佳抗体浓度，或在浓度较低抗体中延长孵育时间（最好是缓慢而准确地结合）。

孵育温度过高

4°C 孵育切片或细胞

二抗发生了非特异性结合（被损坏）

不加一抗，做二抗对照。

组织冲洗不彻底，有固定剂残留

所有步骤都要用 PBS 充分洗涤。

存在内源性过氧化物酶活性

用酶抑制剂如抑制碱性磷酸酶的盐酸左旋咪唑 (2mM)，或抑制过氧化物酶的 H2O2 (0.3% v/v)。

固定过度（固定剂用福尔马林和多聚甲醛）导致抗体识别抗原位点被修饰

改变抗原修复方法，缩短与抗原修复液的孵育时间。

信号过度放大（信号放大技术）

缩短信号放大孵育时间，稀释信号扩大试剂盒。

底物过量（酶检测法）

缩短底物孵育时间

染料与 PBS 在细胞/组织中相互作用（酶检测法）

用 Tris 缓冲液冲洗切片后，再与底物孵育。孵育后，Tris缓冲液再次冲洗细胞/切片。

通透作用破坏膜并除去了膜蛋白

去除缓冲液中的通透剂

非特异性染色

一抗/二抗浓度过高

降低抗体浓度和或缩短孵育周期。对比不表达目标蛋白细胞的信号强度。

存在内源性过氧化物酶活性

用酶抑制剂如抑制碱性磷酸酶的盐酸左旋咪唑 (2mM)，或抑制过氧化物酶的 H2O2 (0.3% v/v)。

一抗与被染组织同源(如用鼠一抗测鼠组织)，加二抗后，二抗会与同源的所有组织结合

应用与组织非同源的一抗

切片/细胞变干

保持切片/细胞湿度，切勿变干。