出于多种考虑，将小组织片段简单浸泡在固定液中便能得到合适的固定，对大多数组织来说可能是唯一的固定模式。然而更快、更均一的固 定方法是将固定液通过管道系统如心主动脉或腹部主动脉灌注到组织中。下面介绍一下用 4% 多聚甲醛固定大鼠大多数器官的操作步骤。

材料

麻醉剂

手术用剪刀、镊子、止血钳

锯齿小镊子

手术刀

放置样品的带塞子的小瓶 (5-10ml)

0.9% 生理盐水

500ml 烧杯

4% 多聚甲醛、固定液

手套、防护眼镜

蠕动泵（或将烧瓶固定在距手术台上方 150cm 处，口向下）

心主动脉灌注用输液针，长 50mm，外径 1.3-1.5mm

带有静脉输血用的滴注腔的灌注装置

心脏灌注固定法

1.设置蠕动泵，安装灌注装置和输液针。首先，取 100ml 水冲洗管道除去管内残留物，然后烧杯盛满 4% 冷多聚甲醛（冰盒预冷），将灌注 管末端置入烧杯中。溶液体积应该与动物大小成比例，通常对于一只动物来说 100-200ml 足够。打开阀门，调节到一个缓慢而稳定的速度 (20ml/min)，然后关闭阀门。

2.在操作台上将剪刀、镊子和止血钳放在适宜操作的位置。给动物注射合适剂量的麻醉剂。动物一旦处于麻醉状态后，将其背部向下放在操 作台上。可以使用带子固定确保动物不动。

3.用捏反应法检测麻醉程度。在开始下述操作之前确保动物是无反应的。

4.在腹部用手术刀沿着膈肌切一个口，用锋利的剪刀剪开膈肌底部连着的组织，确保能进入胸腔。

5.取大号剪刀，钝端向下，切穿左胸肋廓。

6.横向切穿肋骨一到两厘米，打开胸腔。用止血钳打开，使心脏暴露出来。准备排血和输液装置。

7.用镊子固定住心脏（心脏应该还在跳动），在左心室跳动部位直接插入针头，垂直外露 5mm。注意针头不要插入太多，以防刺破心室壁 影响溶液循环！用止血钳将针头固定在输入口。打开阀门使 0.9% 的生理盐水以缓慢、稳定的流速大约 20ml/min 输入动物体内。

8.用剪刀在心房处剪一个口，保证溶液自由流动。如果溶液不能自由流出或溶液从动物的鼻孔或口腔流出，则要让针头复位。

9.当血液快排干时，换上 4% 多聚甲醛溶液（200-300ml）。

(换液时注意不要引入气泡。灌注过程中最好带上防护眼镜，因为有时连接的管道会崩开使固定液喷射到眼睛里。)

当肝脏自发跳动（福尔马林“跳舞”）及颜色变浅时表明灌注完成。（注：一般地，一只成年大鼠的灌注时间大约是 30-60 分钟，但是根据 动物大小和技术的不同也有所差别）。

10.终止灌注，切除靶组织，放置盛有同种固定液的小瓶中，冰上或 4°C 固定 2 小时，再脱水包埋。4°C 浸泡过夜固定，效果更好。

腹主动脉灌注法

1.按上述方法准备材料和动物（步骤 1-3）。

2.在腹部正中横向剪开一个长切口，打开腹腔，将肠道轻轻推至腹腔左侧。

3.小心地将肾主动脉始端下方的主动脉露出。轻轻地将腹主动脉与覆盖其上的脂肪组织及其它粘联组织剥离开。

4.用小镊子将主动脉壁牢牢地固定在距远端 0.5-1.0cm 分叉处。然后将折针紧贴镊子插入主动脉腔的近心端。

5.快速连续操作以下步骤:

a. 用小剪刀在下腔静脉剪开一个口。

b. 灌注。

c.夹住膈肌下方肾主动脉始端上方的主动脉。

操作时，精确度和速度是非常重要的。因此，固定步骤最好两个人操作。

灌注开始后迅速夹住主动脉至关重要，最简单的方法就是用手指（带手套）抵住腹腔的后壁压住主动脉，

然后换上止血钳。最后切除受压上游的主动脉。

6.肾脏表面呈现颜色均一、变浅发白时表明灌注完成。灌注一只成年大鼠来说流速至少要控制在 60-100ml/min。灌注 3 分钟。终止灌注，切 除并清理靶组织，并将之放置到盛有同种固定液的小瓶中（见后面的固定步骤），冰上或 4°C 固定 2 小时。4°C 浸泡过夜固定，效果更好。

7.脱水包埋组织。