缓冲液和试剂

通常将未知浓度样品与阳性对照标准曲线相比较，可精确定量。每块板都要带标准（做平行或者三份）和空白对照以保证精确性。

常规程序

包被抗原

1.用 PBS 或碳酸盐缓冲液稀释抗原至终浓度 20μg/ml。用吸管吸取 50μl 稀释抗原到 PVC 微孔板上的第一排孔，按要求往后进行系列稀释。

(样品纯度较高时通常在酶标板上稀释到不低于 2μg/ml。不一定用纯化的溶液，不过，一般在试验样品中目的蛋白（抗原）含量需大于 3%。抗原的蛋白浓度在酶标板上应该不高于 20μg/ml，此时已经足够中和酶标板上的位点了。确保抗原的浓度在抗体可以检测到的范围内。）

2.在酶标板上覆盖封口膜，室温孵育 2 小时，或者 4°C 过夜。包被的孵育时间需要优化。

3.倒掉孵育溶液，用 PBS 每孔 200μl 洗板 3 次。在水池上轻甩倒掉洗液，在纸巾上轻拍酶标板除去残留液体。

封闭

4.用 200μl 含 5% 脱脂奶粉或含 5% 血清的 PBS 缓冲液封闭酶标板上剩余的蛋白结合位点。或者用其他封闭剂如 BlockACE、BSA（牛血清 蛋白）代替。

5.用封口膜覆盖酶标板室温至少孵育 2 小时，或者 4°C 过夜。

6.用 PBS 洗板 2 次

加一抗和二抗进行孵育

7.每孔加入 100μl 稀释好的一抗。

8.用封口膜覆盖酶标板室温孵育 2 小时，该孵育时间需要进行优化。尽管 2 小时的孵育通常可以获得足够强的信号，但如果获得的信号较弱时 ，通过 4°C 孵育过夜通常可以获得较强信号。

9.用 PBS 洗板 4 次。

10.加 100μl 标记二抗，稀释到最佳浓度（参照说明书），使用前用封闭液现配。

11.用封口膜覆盖酶标板室温孵育 1-2 小时。

12.用 PBS 洗板 4 次。

信号较弱时 ，通过 4°C 孵育过夜通常可以获得较强信号。

检测

虽然许多种类的酶都可以用来检测，但辣根过氧化物酶 (HRP) 和碱性磷酸酶 (AP) 在 ELISA 实验中是被广泛应用的两种酶。我们

必须要考 虑到一些生物原料本身具有很高水平的酶活性（例如肺泡细胞中高含量的 AP，红血球中高含量的过氧化物酶），这可

能导致不精确的结果。 如果有必要的话，用左旋咪唑（针对 AP）或含 0.3% 双氧水溶液的甲醇（针对过氧化物酶）进行一个附加

的封闭处理。

AP 底物

pNPP（对硝基苯基磷酸盐）是最广泛使用的底物。室温下孵育 15-30 分钟后，硝基酚的黄颜色可以在 405nm 下被检测出（这一反

应可以通 过加入适当量的 0.75M 氢氧化钠溶液来终止）。

HRP显色剂

HRP 的底物是过氧化氢，反应中，过氧化氢分裂使氢供体氧化产生颜色变化。

TMB (3,3’,5,5’-四甲基对二氨基联苯)

加 TMB 溶液至每孔，孵育 15-30 分钟，加相同分量终止液（2M 硫酸），在 450nm 下读取吸光度值。

OPD (邻苯二胺盐酸盐)

终产物在 492nm 下检测。需要注意的是这种底物对光敏感，因此需要避光保存。

ABTS (2,2’-连氮-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)磷酸氢二铵盐)

终产物是绿色的，在 416nm 测定吸光度值。

注意：一些酶底物是有害的（致癌物），因此必须小心操作并佩戴手套。

13. 用多通道吸液器向每孔加入 100μl（或 50μl）底物。

14. 显示出足够深的颜色之后，再向每孔加终止液 100μl（如果必须）。

15. 用酶标仪读每个孔的吸光度值（光密度）。

数据分析

根据连续稀释的数据制作一条标准曲线，x轴为浓度（对数转换），y轴为吸光度值（线性）。将样品吸光度值代入标准曲线求出浓度。