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数据库搜索 (Databases search)

发布者:米乐app下载(中国)官网 科技    发布时间:2021-05-24     
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一般来说,利用质谱数据鉴定蛋白质主要有两种方法:肽质量指纹图谱(PMF)和肽序列标签分析(sequence tag analysis)。这两种方法较传统的 N 端测序或内部 Edman 测序法敏感数百倍,其检测低限为飞摩尔(fmol)水平(如银染的 2D胶点或 1D 胶带)。然而,足够多的样品蛋白量可以增加识别的成功率,这是因为增大样品蛋白量可以克服一些污染物的干扰(如角蛋白,在样品中的存在非常常见)。数据库的检索是利用计算机程序算法将实验测得的肽质量数据与蛋白质序列数据库中的蛋白质的肽质量计算值进行相关性比较分析,从而得出可能蛋白质的概率并将相关性最好的结果排序,这是凝胶分离蛋白质鉴定的最常用手段。


这种检索途径有一个明显的限制,就是被鉴定的蛋白质必须在序列数据库(蛋白质数据库和核酸序列翻译数据库)中存在。PMF 检索鉴定蛋白质是依据实验中获得的蛋白质的多个肽段质量数据与同一蛋白质肽段质量理论计算值的之间的相关性比较。因此,这一技术不适用于检索 EST 翻译序列,也不适用于鉴定蛋白质的混合物。而肽序列标签分析(sequence tag analysis)可适用于检索EST 数据库。对PMF 数据,主要搜索Swiss Prot (速度快但不全面)和NCBI (速度虽慢但包含更多的信息)数据库。如果你认为你的蛋白质可能为新的蛋白质,选择NCBI数据库,标准搜索选择Swiss Prot 数据为好。如果需要,也可搜索EST数据库(用MS/MS数据按搜索更有效)。


检索条件的设置与结果判断:


1.肽片段质量选择在 800-4000Da 范围。


2.氨基 酸 残 基 的 修 饰 ( Modifications ):半 胱 氨 酸 为 脲 甲 基 半 胱 氨 酸(Cardamidomethyl-Cys),蛋氨酸选择可变修饰—氧化。


3. 最大允许的肽质量误差( Mass Tolerances),与仪器性能和数据质量有关,一般设为±0.1Da,最大为±0.5Da,质量误差愈小,搜索的特异性愈高。


4. 不完全酶解位点数目(Missed cleavages):每个肽允许有 2 个不完全裂解位点,一般选 1(如果蛋白充分变性且酶解完全)。


5. 参考蛋白质表观分子量和等电点,表观 PI 误差范围为±0.5pH,表观 Mr 误差为范围为±20%。一般情况下不选此项,在判读结果时参考。


6. 物种选择:限定物种。


7. 离子选择:[M+H]+,单同位素


8. 最少匹配肽片段规定为 4。

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